Avance en el último año de la Investigación del Dr. Benoit Gauthier

Viernes, 10 Enero, 2020

TITULO DEL PROYECTO:

ACTIVACION POR AGONISTA DE LRH1/NR5A2 PARA LA ESTIMULACIÓN DE LA TRANSDIFERENCIACION DE CELULAS ALFA A CELULAS BETA EN UN MODELO PRECLINICO DE DIABETES AUTOINMUNE

INVESTIGADOR PRINCIPAL:

Benoit R Gauthier

INSTITUCION:

CABIMER: Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa

Memoria de seguimiento del proyecto

1) El impacto beneficioso de BL001 sobre la supervivencia de los islotes está mediado directamente por LRH-1/NR5A2.

Una cuestión de gran relevancia que queda por abordar es la especificidad de la activación directa de LRH-1/NR5A2 por BL001, que resulta en la protección de los islotes frente a la apoptosis inducida por estrés2. Demostrar la especificidad de la acción de BL001 es de gran importancia para poder excluir acciones “off-target” del compuesto, que pudieran impedir el desarrollo de una terapia anti-diabética efectiva basada en la activación de LRH-1/NR5A2. Para el abordaje de este objetivo in vivo en un modelo preclínico hemos generado una línea de ratón portadora de varios transgenes, que nos ha permitido, mediante el tratamiento de los animales con Tamoxifén (TAM), delecionar LRH-1/NR5A2 específicamente en células beta a diferentes estadíos de la vida del ratón. Esta deleción condicional de LRH-1/NR5A2, que posibilita la supresión de la expresión de este gen en animales adultos, es de gran relevancia ya que tal como hemos demostrado previamente la falta de este LRH-1/NR5A2 durante el desarrollo embrionario causa letalidad postnatal 2. Utilizando este modelo animal, hemos demostrado en primer lugar que el tratamiento de animales adultos con TAM suprime la expresión de LRH-1/NR5A2 específicamente en las células beta, no afectando a la expresión de este gen en otros tejidos como hígado o cerebro. También hemos comprobado que este tratamiento no causa alteraciones en la glucemia de los animales ni en su peso y tampoco resulta nocivo para el hígado. Posteriormente hemos analizado el efecto de la administración de BL001 a estos animales previamente tratados o no con TAM e inyectados con streptozotocina (STZ) que induce la destrucción de la masa de células beta. Tal como hemos descrito anteriormente para ratones wt 2, El tratamiento con BL001 de los animales no tratados con TAM protege del desarrollo de diabetes inducida por STZ , detectándose hiperglucemia solo en el 20-30% de los animales. Esta protección resulta bloqueada en los animales en los que se ha delecionado LRH-1/NR5A2 mediante el tratamiento con TAM, entre los que el 80% de los ratones desarrolla hiperglucemia. El análisis histológico de los páncreas de estos animales ha revelado que los islotes de animales hiperglucémicos tratados con TAM/STZ/BL001 carecen de células beta mientras que los ratones control normoglucémicos tratados con STZ/BL001 poseen islotes sanos. Estos resultados demuestran que las propiedades antiapoptóticas de BL001 son específicamente debidas a la activación de la ruta de señalización de LRH-1/NR5A2.

2) BL001 estimula la ‘transregeneración’ de la masa de células beta.

Nuestro trabajo previo indica que el tratamiento con BL001 estimula la conversión de células alfa a células beta 2. Con el fin de validar irrefutablemente este proceso, hemos generado un ratón transgénico, portados de varios transgenes diferentes en el que mediante tratamiento de los animales con doxiciclina (DOX) se activa la expresión del marcador fluorescente YFP específicamente en células alfa. La utilización de esta técnica celular, conocida como “seguimiento de linaje”, en ratones tratados con STZ y BL001 nos permitirá determinar si las nuevas células beta formadas provienen de células alfa, en cuyo caso expresarían YFP. Nuestros experimentos preliminares han revelado la existencia de células beta que son positivas para YFP en ratones tratados con DOX/BL001/STZ, validando así la existencia de conversión de células alfa a células beta

3) Evaluar la capacidad de BL001 para inducir la polarización de macrófagos procedentes de individuos sanos o con DMT1 hacia el fenotipo antiinflamatorio M2.

El razonamiento para este trabajo, actualmente en curso, es trasladar a macrófagos primarios humanos el papel inmunomodulador de la activación de LRH-1 por BL001 observado en ratón. En este estudio haremos especial énfasis en los macrófagos aislados de individuos con DMT1. De hecho, el ambiente diabético interfiere con la capacidad de los macrófagos para adquirir un fenotipo M2 anti-inflamatorio/remodelador de tejidos 3,4. Determinar si BL001 puede evitar este bloqueo diabético es de gran relevancia para el desarrollo de intervenciones terapéuticas que impliquen una transregeneración mediada por el sistema inmune en pacientes diabéticos. Para llevar a cabo este objetivo, hemos recogido muestras de sangre de 4 individuos sanos y 4 con DMT1 en el área de Cádiz, de las que hemos aislado CD14+ PBMCs (4-8 millones de células /donante). Estas células se han diferenciado hacia macrófagos con un fenotipo activado M1 (M10; CD14+/CD80+/CD163-/ CD206+) utilizando el kit CellXVivoTM human M1 macrophage differentiation (R&D Systems) y posteriormente han sido tratadas o no durante 24 horas con BL001 a 0.1, 1 y 10 µM 2. De acuerdo con nuestra premisa, el tratamiento de macrófagos M10 de donantes sanos con BL001 a baja concentración (0.1 y 1 uM) disminuye significativamente la expresión de CD80 (marcador de M1) a la vez que aumenta la expresión de CD163 (marcador de M2) y de CD206 (marcador M1/M2). En macrófagos M10 de donantes con DMT1 tratados con BL001 1 uM se observa un descenso de CD80 y aumento de CD206 similar, aunque no resulta significativo. Interesantemente, CD163 también se encuentra disminuido en estas células. Aunque preliminares, estos datos indican que BL001 puede inhibir el fenotipo activado M10 en macrófagos requiriéndose una mayor dosis del compuesto en el caso de individuos con DMT1. Lo que sugiere que BL001 pudiera estar bloqueando el bloqueo diabético. Actualmente estamos explorando esta premisa para lo que se están recogiendo nuevas muestras de sangre (de individuos sanos y con DMT1) a través de diferentes hospitales.

4) Evaluar la capacidad de BL001 para inducir un fenotipo tolerogénico en células dendríticas (tolDCs) aisladas de individuos sanos o de pacientes con DMT1.

El razonamiento para este estudio es determinar si BL001 puede directamente inducir la transición del fenotipo DC maduro (mDC) hacia tolDC, especialmente en pacientes con DMT1, desencadenando así una cascada anti-inflamatoria. Se obtuvieron muestras de sangre de 6 pacientes con T1DM en el área de Barcelona. Actualmente se están recogiendo y procesando muestras de sangre de donantes sanos para su evaluación. El aislamiento de CD14+PBMCs y su posterior derivación a células dendríticas inmaduras (IDCs) y mDCs ha sido realizado tal como se ha descrito anteriormente 5. Células dendríticas inmaduras incubadas en presencia de liposomas de fosfatidilserina fueron usadas como referencia para las características tolerogénicas (tolDCs) 5. En primer lugar, hemos evaluado la viabilidad de las DCs en respuesta a concentraciones crecientes de BL001. Al igual que en las células de los islotes 2, BL001 a una concentración de 100 uM parece ser tóxica en el 50% de las DCs. Los cambios inducidos por BL001 en el fenotipo de las DCs fueron evaluados mediante citometría de flujo utilizando los siguientes marcadores de superficie celular: CD40 y CD86 (moléculas coestimuladoras), CXCR4 (receptor de quemoquinas), HLA-DR (molécula presentadora de antígeno) and CD54 (molécula de adhesión). La expresión de estos marcadores está implicada en la respuesta inmune adaptativa, a través del aumento de la presentación de antígeno, así como en la activación de las células T, por lo que es indicativa de mDCs, mientras que su inhibición está asociada con tolDCs. En consecuencia, todos los marcadores se encontraron incrementados en mDCs al compararlas con iDCs. La adición de concentraciones crecientes de BL001 (hasta 50uM) a mDCs resultaron en una supresión significativa de CD86, CXCR4 y CD54, y el bloqueo de la expresión de HLA-DR y CD40. De acuerdo con la inducción de un fenotipo tolerogénico, la inducción de la proliferación de las células T CD4+ o CD8+ por mDCs resultó fuertemente inhibida por BL001. Tomados en conjunto, estos resultados preliminares demuestran claramente la capacidad de BL001 para promover un fenotipo tolerogénico en las DCs aisladas de pacientes con DMT1. Actualmente estamos incrementando el número de muestras tanto de donantes sanos como de pacientes con DMT1.

5) Plan de trabajo para la continuación del estudio.

Los estudios futuros que proponemos realizar incluyen la evaluación de: 1) si las células inmunes humanas tratadas con BL001 y tolerizadas pueden estimular/facilitar la transdiferenciación de células alfa humanas in vitro y 2) si BL001 puede estimular la conversión de células alfa a células beta in vivo y revertir la diabetes en un modelo preclínico de xenotransplante en ratón. Para llevar a cabo este último objetivo recientemente hemos establecido una colaboración con el Alberta Diabetes Institute para la adquisición de islotes humanos

Referencias bibliogáficas

1 Cobo-Vuilleumier, N. & Gauthier, B. R. Time for a Paradigm Shift in Treating Type 1 Diabetes Mellitus: Coupling Inflammation to Islet Regeneration. Metabolism: clinical and experimental 104, doi:10.1016/j.metabol.2020.154137 (2020).
2 Cobo-Vuilleumier, N. et al.LRH-1 agonism favours an immune-islet dialogue which protects against diabetes mellitus. Nat Commun 9, 1488, doi:10.1038/s41467-018-03943-0 (2018).
3 Ahmed, M., de Winther, M. P. J. & Van den Bossche, J. Epigenetic mechanisms of macrophage activation in type 2 diabetes. Immunobiology 222, 937-943, doi:10.1016/j.imbio.2016.08.011 (2017).
4 Di Marco, E., Gray, S. P. & Jandeleit-Dahm, K. Diabetes alters activation and repression of pro- and anti-inflammatory signaling pathways in the vasculature. Front Endocrinol (Lausanne) 4, 68, doi:10.3389/fendo.2013.00068 (2013).
5 Rodriguez-Fernandez, S. et al.Phosphatidylserine-Liposomes Promote Tolerogenic Features on Dendritic Cells in Human Type 1 Diabetes by Apoptotic Mimicry. Front Immunol 9, 253, doi:10.3389/fimmu.2018.00253 (2018).